En 1641, il est prouvé que son père était organiste à l'église Saint-Olaï de Helsingør.

En tant qu'organiste, il travaille depuis 1657 à l'église Sainte-Marie de Helsingborg, et de 1660 à 1668 à l'église Sainte-Marie (également appelée église allemande) de Helsingør. Le 11 avril 1668, il succéda à Franz Tunder à Sainte-Marie de Lübeck, dont il épousa la deuxième fille, Anna Margaretha, le 3 août de la même année ; il y assuma également des tâches administratives et la comptabilité en tant que "Werckmeister". Le couple eut sept enfants, dont trois survécurent à leur père. Il poursuivit la série de concerts spirituels de l'Avent fondée par son beau-père et appelée Abendmusiken (musique du soir) depuis 1673, qui le fit connaître et rendre célèbre en tant que compositeur et organiste virtuose. Dès 1669, les responsables de l'église Sainte-Marie firent installer des galeries latérales dans la galerie supérieure, de part et d'autre de l'orgue, ce qui permettait de jouer de la musique depuis ces galeries en même temps que le grand orgue.

En 1705, Johann Sebastian Bach a parcouru à pied plus de 465 kilomètres entre Arnstadt (Thuringe) et Lübeck pour écouter son modèle musical, Buxtehude, et a probablement pris des cours avec lui. Le séjour à Lübeck était si important pour Bach qu'il prolongea de son propre chef ce "congé de formation" de 12 semaines, ce qui lui valut d'être entendu et réprimandé par ses supérieurs à Arnstadt. Bach ne semble toutefois pas s'être intéressé à la succession de l'organiste vieillissant, contrairement à Georg Friedrich Händel ou Johann Mattheson qui envisageaient ce poste et se sont donc rendus à Lübeck en 1703. Tous deux n'ont cependant pas ressenti le besoin d'épouser, selon la coutume de l'époque, la fille de l'organiste de la Vierge en place afin de pouvoir lui succéder. C'est également le cas de Bach, qui était de toute façon déjà fiancé à cette époque à Maria Barbara Bach. Le successeur de Buxtehude fut finalement Johann Christian Schieferdecker, qui épousa sa fille aînée Anna Margreta, née en 1675 et déjà décédée vers 1709.

Dieterich Buxtehude est le représentant le plus célèbre de l'école d'orgue d'Allemagne du Nord. Son élève le plus connu était Nicolaus Bruhns.

Buxtehude est mort le 9 mai 1707 et a été enterré dans l'église Sainte-Marie de Lübeck, près de l'orgue dit "de la danse macabre".