D'origine juive, Mario Castelnuovo-Tedesco étudie le piano à Florence, puis la composition à Bologne où il est défendu par Alfredo Casella. Il déploie une activité de pianiste, de compositeur mais aussi de critique musical. Sa première œuvre d'importance est un opéra, La Mandragola (d'apres Machiavelli), crée à la Fenice de Venise en 1926. Il est également connu pour ses œuvres pour guitare, dues à sa rencontre avec Andrès Segovia à Venise en 1932 : près d'une centaine de partitions pour cet instrument ont été écrites, dont des concertos.

En 1931, il compose un concerto pour violon sur la demande de Jascha Heifetz. À partir de 1938, il subit de fortes pressions du régime Mussolinien du fait de ses origines juives. Il quitte en 1939 l'Italie pour les États-Unis. Là, il écrit de nombreuses musiques de film, ainsi que d'autres pièces, en particulier religieuses (Naomi and Ruth op 22, Sacred service for the Sabbath Eve) et quelques opéras sur des textes de William Shakespeare.

Il ne s'est reconnu dans aucune école et sa musique combine des inspirations italiennes et juives.