1641 war sein Vater nachweislich Organist an der St.-Olai-Kirche in Helsingør. Dort absolvierte Dieterich Buxtehude vermutlich die Lateinschule.

Als Organist wirkte er seit 1657 an der Marienkirche in Helsingborg, 1660 bis 1668 an der Marienkirche (auch Deutsche Kirche) in Helsingør. Am 11. April 1668 wurde er Nachfolger Franz Tunders an St. Marien in Lübeck, dessen zweite Tochter Anna Margaretha er am 3. August desselben Jahres heiratete; dort übernahm er als „Werckmeister“ auch Verwaltungsaufgaben und die Rechnungsführung. Das Ehepaar bekam sieben Kinder, von denen drei den Vater überlebten. Er führte die von seinem Schwiegervater begründete, seit 1673 Abendmusiken genannte Reihe adventlicher geistlicher Konzerte fort, die ihn als Komponisten und virtuosen Organisten bekannt und berühmt machte. Schon 1669 ließen die Kirchenvorsteher der Marienkirche Seitenemporen im Obergaden zu beiden Seiten der Orgel anbringen, die es ermöglichten, von dort zusammen mit der großen Orgel zu musizieren.

1705 legte Johann Sebastian Bach die mehr als 465 Kilometer von Arnstadt (Thüringen) nach Lübeck zu Fuß zurück, um sein musikalisches Vorbild Buxtehude zu hören, und nahm vermutlich Unterricht bei ihm. Der Aufenthalt in Lübeck bedeutete für Bach so viel, dass er diesen „Bildungsurlaub“ eigenmächtig um 12 Wochen verlängerte und er deshalb von seinen Vorgesetzten in Arnstadt vernommen und gerügt wurde. Bach scheint sich jedoch für die Nachfolge des alternden Organisten nicht interessiert zu haben, im Gegensatz zu Georg Friedrich Händel oder Johann Mattheson, die diese Stelle in Erwägung zogen und deshalb 1703 nach Lübeck reisten. Beide verspürten jedoch kein Bedürfnis, nach damaligem Brauch die Tochter des amtierenden Marienorganisten zu heiraten, um dessen Nachfolge antreten zu können. Das galt auch für Bach, der zu dieser Zeit ohnehin schon mit Maria Barbara Bach verlobt war. Nachfolger Buxtehudes wurde schließlich Johann Christian Schieferdecker, der dessen älteste, 1675 geborene und bereits um 1709 gestorbene Tochter Anna Margreta heiratete.

Dieterich Buxtehude ist der berühmteste Vertreter der Norddeutschen Orgelschule. Sein bekanntester Schüler war Nicolaus Bruhns.

Buxtehude starb am 9. Mai 1707 und wurde in der Lübecker Marienkirche in der Nähe der sogenannten „Totentanzorgel“ beigesetzt.